常見(jiàn)問(wèn)題

常見(jiàn)問(wèn)題

GSP在擴增低豐度的轉錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(cháng)轉錄本的逆轉錄;隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進(jìn)行體外轉錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。 有可能是引物二聚體的條帶

大多數情況下是由于退火溫度過(guò)低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的 對于長(cháng)片段的PCR,建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

在PCR反應體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高 減少引物的用量 優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí),其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增,一般會(huì )顯示為彌散背景。

用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶,則需要用DNase I重新處理樣品。 在PCR反應中,非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火,降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。 由于mRNA剪切方式的不同,根據選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。

最常見(jiàn)的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系 與反應起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān) 建議在試驗中加入對照RNA 第一鏈的反應產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴增時(shí),在總的反應體系中的含量不要超過(guò)1/10 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構,如環(huán)狀結果,有可能導致GSP無(wú)法與模板退火;或SSⅡ反轉錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。 目的mRNA中含有強的轉錄中止位點(diǎn),可以試用以下方法解決:  a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。  b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應。

human U6 promoter表達框包括human U6 promoter、終止碼TTTTT和中間自行設計的抑制序列或抑制序列的發(fā)卡結構。從人基因組中可以擴增出U6 promoter,后面的序列全部自己設計。

可能原因是stem的長(cháng)度剛好和primer相當,所以primer退火時(shí)hairpin結構也形成,從而影響測序。分析一下發(fā)現它與stem的長(cháng)度及序列有關(guān)。冷泉港推薦改變sense strand上幾個(gè)堿基,使其在DNA水平不互補,但RNA卻能利用G-U互補形成hairpin。

目前發(fā)表的RNAi表達載體大多采用3型Pol III啟動(dòng)子,如human/mouse U6啟動(dòng)子等。其中人U6啟動(dòng)子有幾個(gè)明顯的特點(diǎn):1.具有TATA box,位于-30~-25bp,被Pol III轉錄;2.在轉錄起點(diǎn)上游-66~47bp處存在PSE(proximal sequence element),該元件是snRNA激活因子蛋白復合物的結合位點(diǎn);3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element);4.啟動(dòng)子下游存在5'-TTTT-3'序列為Pol III提供轉錄終止信號;5.PSE和DSE之間的距離變化可顯著(zhù)影響轉錄效率;6.+1位的G對轉錄效率影響較大。根據這些特點(diǎn),在使用U6啟動(dòng)子構建RNAi表達載體時(shí),U6啟動(dòng)子的長(cháng)度最好在300bp左右,盡量不改變PSE和DSE的間距,同時(shí)保留TATA box和+1位的G,在下游應有5'-T噑TTT-3'序列作為終止信號。另外可以根據需要在啟動(dòng)子上游或終止信號下游設計測序引物序列、酶切位點(diǎn)等等。  如有興趣可以利用同尾酶設計poly-RNAi表達載體,從而可以觀(guān)察同時(shí)knockdown兩個(gè)或多個(gè)基因表達后產(chǎn)生的效應。若是條件允許,可以對U6啟動(dòng)子進(jìn)行shuffling,篩選具有特殊用途的突變的Pol III啟動(dòng)子。

因為人工合成siRNA價(jià)格太高,現在經(jīng)常采用RNAi expression vector,抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III啟動(dòng)子時(shí)轉錄終止碼為5'-TTTTT-3',而使用Pol II啟動(dòng)子則為polyA。其實(shí)這兩種終止碼都不能完全避免通讀(readthrough)現象的發(fā)生?,F在RNAi多用前者,是因為其較短,不形成復雜的空間結構;后者因為較長(cháng),形成的空間結構可能會(huì )對抑制序列發(fā)卡結構的形成構成空間阻礙或產(chǎn)生遮擋效應。

可以,這些載體都是真核表達載體,根據國外的經(jīng)驗,質(zhì)粒載體的knockdown作用一般僅持續一周左右,一周后被down的RNA水平即恢復原有水平,其機制尚未闡明。推薦使用逆轉錄病毒載體達到穩定轉染的效果。

上海吉瑪的supersilencing shRNA 載體分別使用Pol III依賴(lài)H1或者U6的啟動(dòng)子。盡管H1和U6是polⅢ 型啟動(dòng)子,然而可能根據使用細胞系的不同,效率有些小的差別。

使用pol III型啟動(dòng)子是為了有效表達shRNA。這些pol III型啟動(dòng)子包含了表達RNA上游所有的必要的元件,而且在一個(gè)短的多聚胸苷區內終止。一旦shRNA被表達,它被轉移出細胞核,在細胞質(zhì)中被Dicer加工成siRNA。Dicer優(yōu)先識別由 pol III型啟動(dòng)子產(chǎn)生的shRNA,因為它們不帶有5’或者3’兩側連接的序列。siRNA進(jìn)入RISC復合體中,在哺乳動(dòng)物細胞中產(chǎn)生RNAi效應。

在哺乳動(dòng)物細胞中,RNAi可以通過(guò)直接導入特異阻斷所選擇基因表達的分子而誘導,導致產(chǎn)生基因功能缺失表型。這些分子可以通過(guò)化學(xué)合成、體外方法制備或者細胞內DNA模板產(chǎn)生。前兩種方法只能用于瞬時(shí)阻斷,可能很難導入難以轉染的、不分裂的或者原代細胞類(lèi)型。通過(guò)載體導入pol III 啟動(dòng)子表達的短的發(fā)夾RNA(shRNA)擴展了RNAi實(shí)驗的選擇,包括穩定和可誘導表達以及病毒導入。

最常見(jiàn)的影響沉默效果的兩個(gè)原因是:轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的細胞系,并發(fā)現沉默效果不佳,我們建議您對轉染效率進(jìn)行檢測,并選擇優(yōu)化轉染條件。如果您已經(jīng)對實(shí)驗轉染條件進(jìn)行優(yōu)化但是問(wèn)題依然存在,我們建議您換用另一種轉染試劑或是采用其他技術(shù),這也許能提高轉染效率。如果已經(jīng)提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求,可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。

迄今為止還沒(méi)有明確的siRNA體內實(shí)驗使用量的計算方式,在實(shí)驗前最好先從文獻中查詢(xún)是否已經(jīng)有相關(guān)的文章發(fā)表。對于常規實(shí)驗,一般使用100 μL的注射體積,濃度為10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明,當劑量大于20 mg/kg/day (416 mM)時(shí),會(huì )觀(guān)察到明顯的毒性。最好針對您的實(shí)驗繪制劑量反應曲線(xiàn)。 常規情況下,給藥劑量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作為優(yōu)化起點(diǎn)。需要注意的是,這個(gè)劑量只是一個(gè)預實(shí)驗的起點(diǎn),最后的給藥劑量取決于動(dòng)物模型、靶基因、靶組織和給藥方式等因素

上海吉瑪 的siRNA經(jīng)過(guò)嚴格HPLC純化,已經(jīng)被用戶(hù)通過(guò)局部注射用于小鼠的體內實(shí)驗,并且得到滿(mǎn)意的實(shí)驗結果。

寡核苷酸可以通過(guò)大劑量給藥或使用ALZET微小泵持續給藥。大劑量給藥時(shí)要慎重,因為已有研究表明:一些毒性與寡核苷酸反義鏈的濃度有關(guān),快速給藥時(shí)可能會(huì )導致動(dòng)物下肢癱瘓或致死,所以給藥時(shí)要注意觀(guān)察。很多已發(fā)表的論文實(shí)驗是通過(guò)尾靜脈給藥的。任何給藥方式都需要優(yōu)化,以確保最佳的導入方式和動(dòng)物的健康。一般拿靜脈注射來(lái)說(shuō),每天注射一到兩次,連續注射一到兩周。

體內實(shí)驗設計包含動(dòng)物模型的選擇、給藥途徑、劑量和給藥次數等等。siRNA使用的數量及濃度主要取決于給藥靶點(diǎn)的性質(zhì),諸如腫瘤的類(lèi)型,組織的類(lèi)型,靶基因表達水平,動(dòng)物模型個(gè)體大小等等,針對不同的研究模型,最好先查閱相關(guān)資料。

我們推薦RT-PCR的引物應該設計在target位置的兩側,而不是同側。目前已經(jīng)知道的siRNA介導的基因knockdown機制是RSIC先介導靶mRNA的切割,切割導致靶mRNA的降解,由于切割和降解可能具有不同的時(shí)間點(diǎn),因此,設計于同側的PCR引物可能導致假陰性結果或knockdown效率的低估。  另外,RT-PCR結果會(huì )因為靶基因mRNA降解時(shí)間不同、細胞內靶基因mRNA豐度不同而導致假陰性結果,特別對于豐度較高的基因,推薦使用的檢測方式包括定量PCR、Northern檢測、western檢測等。這些方法會(huì )更加真實(shí)的反映RNAi的結果。

反義核酸和RNAi從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹:從原理上說(shuō),反義核酸是一段與靶基因配對的單鏈DNA或類(lèi)似DNA的片段與靶基因結合,結果阻止靶基因的轉錄或是翻譯,以往的研究表明在反義核酸的研究中,序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關(guān)性,這就在一定程度上限制了反義核酸的應用。  RNAi的作用機理是雙鏈的RNA進(jìn)入細胞內,導致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以選擇在高度特異針對靶基因的位置,也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術(shù)問(wèn)世以來(lái),國外很多專(zhuān)業(yè)從事反義核酸研究的公司都紛紛轉向RNAi研究, ISIS是一個(gè)非常就有代表性的例子。他們認為,如果使用反義核酸可以進(jìn)行的研究,以及反義核酸可以涉及的研究領(lǐng)域,RNAi均可以毫不示弱的開(kāi)展,并且應該會(huì )得到更加令人滿(mǎn)意的結果。  我使用合成的雙鏈DNA克隆載體,但是測序結果不正確,是DNA合成的問(wèn)題,還是其他問(wèn)題?  首先,質(zhì)量良好的、并且是退火狀態(tài)良好的dsDNA是克隆成功的關(guān)鍵因素。一般情況下,需要挑不止一個(gè)克隆測序(通常是2個(gè)以上),如果兩個(gè)克隆的序列都是錯誤的,并且錯誤的堿基是相同的,那么基本可以確定是DNA oligo合成的問(wèn)題. 如果兩個(gè)克隆的不同堿基發(fā)生錯誤,有可能是合成片段本身的問(wèn)題,也有可能是克隆過(guò)程造成的問(wèn)題,可以再多挑1~2個(gè)克隆測序確證。大多數情況下,兩個(gè)陽(yáng)性克隆中,一般至少會(huì )有一個(gè)克隆是正確的,這種個(gè)別堿基在個(gè)別分子中的錯誤是合成和克隆過(guò)程共同造成的,但一般發(fā)生的幾率較低。

用RNAi進(jìn)行pathway研究,是RNAi主要應用之一。在這樣的課題中,對照系統的選擇尤其重要。已經(jīng)發(fā)表的和已經(jīng)驗證的siRNA為RNA干擾研究提供了系統性對照。用RNAi進(jìn)行細胞凋亡相關(guān)基因的研究,以往已經(jīng)有眾多的文獻報道,可以查閱上海吉瑪網(wǎng)站www.wujimen.net。

使用什么樣的轉染方法,很大程度上取決于您使用的細胞系:   1.貼壁的、易轉染的細胞,我們推薦使用RNAi-mate;  2.懸浮的或原代的細胞,我們推薦使用電擊轉化方法;  3.電擊轉化效率仍然很低的細胞,需要選擇載體系統。 上海吉瑪除提供化學(xué)合成的siRNA以外,還提供完整的載體系統,請參閱產(chǎn)品資料。

如果出現細胞大量死亡,意味著(zhù)您的轉染條件仍然需要優(yōu)化:  轉染條件的優(yōu)化一般包括以下幾個(gè)方面:  1. 調整轉染試劑的濃度;  2. 在轉染后適當的時(shí)間內更換無(wú)轉染試劑的培養液,  3.調整細胞的生長(cháng)狀態(tài);一般處于良好生長(cháng)狀態(tài)的細胞對轉染試劑就有更好的耐受性; 4.調整轉染試劑和siRNA的比例; 如果同一管轉染試劑在不同實(shí)驗中對細胞的毒性有差異,一般說(shuō)來(lái)應該是實(shí)驗過(guò)程本身帶來(lái)的差異;  如果已經(jīng)做了以上幾項工作,轉染效率仍然得不到提高,建議您更換一種轉染試劑。

好的轉染試劑有以下特點(diǎn):1、對siRNA有較高的轉染率;2、對細胞的毒性小。在mRNA水平檢測siRNA導入的效果比用看家基因的siRNA陽(yáng)性對照檢測更為準確。

熒光素在495nm處有最大吸收率,在520nm處有最大發(fā)射率。

已經(jīng)有為數不少的實(shí)驗室研究過(guò)熒光標記的siRNA的熒光檢測結果和knockdown效率之間的正相關(guān)關(guān)系。熒光標記雙鏈是最常用的優(yōu)化轉染條件的方法??梢杂昧魇郊毎麅x或者熒光共聚焦顯微鏡檢測標記的siRNA。

研究者可以用Beer法則定量RNA:吸光度(260nm)=(摩爾消光系數)*(濃度)*(路徑長(cháng)度,cm)。為了便于理解,等式變?yōu)椋簼舛龋剑ㄎ舛?260nm)/[(摩爾消光系數)*(路徑長(cháng)度,cm)]。當使用一個(gè)標準的10mm比色皿時(shí),在公式中路徑長(cháng)度這個(gè)變量等于1。 6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有多少u(mài)g的siRNA? 首先計算含有多少nmol的siRNA: a. 等式: nmol = (6 uL)(10 umol/L);b. 單位換算: nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol);c. 答案: nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量(13,300 g/mol)把nmol變?yōu)閡g:a. 等式: ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol);b. 單位換算: ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g);c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。 我需要濃度為20uM的樣品,如何計算重懸siRNA緩沖液的量? 樣品濃度的計算如下:(siRNA的量,nmol)/(重懸體積,uL)=樣品濃度,umol/L。在解答前應先統一單位,確保單位可以抵消。例如:您購買(mǎi)了20nmol的siRNA,想溶解為50uM的樣品??砂匆韵路椒ㄓ嬎阒貞揖彌_液體積:a. 等式: (20 nmol)/ uL = 50 umol/L;b. 解答未知量: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol);c. 單位換算: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L);d.答案: uL = 400 uL。因此,應該使用400uL緩沖液去重懸20nmol的siRNA,溶解后為50uM的樣品。 一定需要陰性對照嗎? 是,陰性對照是RNA干擾實(shí)驗中不可缺少的。由于在超過(guò)200 nM的濃度下,siRNA有可能會(huì )導致非特異性的壓力反應,在實(shí)驗體系中必需設置陰性對照。它能夠幫助我們確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結果。由于siRNA的合成方法和工藝以及轉染試劑等因素可能導致廣泛的基因沉默現象。如果沒(méi)有陰性對照,研究人員很可能錯誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當作由RNAi引起的基因特異性沉默。 常用的陰性對照有哪些類(lèi)型? 常用的陰性對照大體分為兩種,一種是使用通用陰性對照序列,該序列已經(jīng)被上千篇文章使用;另一類(lèi)是使用和靶基因siRNA打亂序列的siRNA作為陰性對照,這樣的陰性對照和通用序列相比較,一方面合是按照定制產(chǎn)品價(jià)格合成的,另一方面,由于打亂序列是沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗證的序列,有可能會(huì )產(chǎn)生off-target現象。因此,除非有非常特殊的要求,最好使用通用序列作為陰性對照。 在陰性對照體系中和實(shí)驗體系中觀(guān)察到同樣的實(shí)驗結果,這是什么原因? 這個(gè)結果充分說(shuō)明了設置陰性對照的必要性。該結果表明您所觀(guān)察到的表型不是序列特異性knockdown產(chǎn)生的表型,您需要降低siRNA的工作濃度。 為什么說(shuō)陽(yáng)性對照在RNA干擾實(shí)驗中很重要? 陽(yáng)性對照作為一個(gè)實(shí)驗系統檢查是很重要的。也就是說(shuō),當您看到siRNA陽(yáng)性對照的預期實(shí)驗結果時(shí),您能確保在您的實(shí)驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。通常最好的陽(yáng)性對照是內在的對照 你們能提供預先合成的siRNA對照么? 可以。吉瑪能提供許多預先合成的用于RNA干擾實(shí)驗的對照雙鏈。 用于對照的siRNA的最佳濃度是多少? 陽(yáng)性對照和陰性對照的siRNA的濃度都應該與基因特異性的siRNA的濃度相同。 不同工作濃度下1OD siRNA可以使用多少次 工作濃度 1 OD siRNA可以使用孔數(孔) 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 100mm dish 5nM 5000 2500

增加siRNA的濃度一般不能改進(jìn)沉默效率。高濃度的siRNA將可能導致去靶作用和對細胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率來(lái)自于合理的設計,在100nM 甚至更低的濃度都可能有75%的沉默效率。另外,低的轉染效率會(huì )導致低的沉默效率,建議您更進(jìn)一步優(yōu)化siRNA的導入條件。

我們建議您用于實(shí)驗的siRNA的濃度為100nM。1nmol siRNA的量對于一個(gè)24孔板或是96孔板的實(shí)驗已經(jīng)足夠了。

吉瑪公司為您提供的siRNA是凍干粉包裝的,在常溫下運輸。這些凍干的樣品在室溫下能穩定保存2-4個(gè)星期,所以放置一個(gè)星期不會(huì )影響其沉默效果。但我們建議您收到樣品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷凍箱中。

懸垂的序列組成是由顧客自行選擇的。最近研究表明懸垂的組成在mRNA靶識別和酶解中不是很重要。懸垂可能在形成RISC的過(guò)程中起結構的作用。很多研究人員選擇dTdT是因為研究表明脫氧核糖核苷能保護siRNA免受酶解。合成序列最重要的是確定靶mRNA的19個(gè)堿基的核心結構。

您需要準確地提供siRNA的19個(gè)核苷酸的靶序列和懸垂的合成物,或者您也可以提供相應地基因的GeneID或者Accession Number,由我們公司技術(shù)人員為您免費設計。

目前RNA寡核苷酸的最大長(cháng)度是50堿基。

吉瑪公司的siRNA是雙鏈的,而且也是按照雙鏈來(lái)定價(jià)的。

一般siRNA都具有物種特異性,很少與其他物種有相同的靶位點(diǎn),所以針對人體基因設計的siRNA不會(huì )沉默其他物種的同源序列。然而,也有研究表明siRNA經(jīng)過(guò)特異性設計后能對兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效,這需要仔細進(jìn)行siRNA設計和生物信息學(xué)分析。對兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效,這需要仔細進(jìn)行siRNA設計和生物信息學(xué)分析。

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